做掃瞄比較(Gene Scan)用

使用Fluorescent Genotyping Demonstration Kits A(#402246)或B(#402247), Kit A可amplify PCR products, Kit B則用于業(yè)已經(jīng)PCR amplified 之樣本.

另須Fluorescent Amidite Matrix Standatds (#401546)

Deionized formamide

filter-sterilized deionied water

若用Kit B則尚須GeneScan-350 size standard(#401736)

ABI Prism 310 10x Genetic Analyzer buffer with EDTA (#402824)

POP-4(#402838)等材料.

在將機(jī)器由做排序轉(zhuǎn)換為掃瞄用時(shí), 須先將毛細(xì)管, gel block, 玻離針筒均洗淨(jìng), 重裝. 并準(zhǔn)備好1x之Genetic Analyzer buffer with EDTA 50ml.

注意：

gel block絕不可以任何有機(jī)溶劑處理. 全程須帶手套. 充填gel方式同排序步驟, 只是gel為POP-4.

1.     由電腦中選About collection software, 由window中選Perferences, 再選Sequence injection list Default, 或GeneScan injection List default, 若電腦要求則輸入139115, 按OK, 再選Collection Software一次.

2.     由Manual Control window之Function項(xiàng), 選Syringe Home 按execute, 再由Function項(xiàng)中選Syringe Max travel, 記下所顯示數(shù)據(jù), 再按Syringe Down, 輸入前項(xiàng)所顯示數(shù)據(jù), 按execute, 在針桿推進(jìn)器與針桿相接時(shí), 停止, 由window中選Status.

3.     在injection項(xiàng)下記下數(shù)據(jù), 將此數(shù)據(jù)減15, 再選Syringe Max Travel, 將上述減去15之?dāng)?shù)據(jù)輸入, 按execute, 將數(shù)據(jù)抄在儀器左側(cè)門內(nèi).

4.     再選Syringe Up, 輸入250, 按execute, ……其馀裝毛細(xì)管, 裝gel, 裝樣本方式均同做排序方式, 然后, 由Instrument項(xiàng)選change capillary, 在Reset項(xiàng)按OK, 使injection counter設(shè)為0. 再由Manual control中選temperature輸入60℃, 按execute.

準(zhǔn)備樣本：

1.     準(zhǔn)備14支0.5ml離心管, 分2列, 每列8支, 每列第7與第8支單獨(dú)放, (簡(jiǎn)寫為A1~A8, B1~B8)

2.     將Kit A置冰上解凍, 將第1列之A1~A6及第2列B1~B6各支中, 各加入9μl Reagent mix, 再加3μl之control DNA 1347-02于A1~A6中, 再于B1~B6中各加3μl Control DNA 1347-10.

3.     在A1,B1中各加3μl D12S83-[FAM].

4.     在A2,B2中各加3μl D7S517-[FAM].

5.     在A3,B3中各加3μl D2S391-[TET].

6.     在A4,B4中各加3μl D13S171-[TET].

7.     在A5,B5中各加3μl D1S220-[HEX].

8.     在A6,B6中各加3μl D3S266-[HEX].

9.     然后每支中各加40μl mineral oil, 蓋好管蓋, 離心1500rpm, 15sec.

10.再進(jìn)行PCR, 95℃, 12min, 1 cycle.

11.再94℃, 15sec, 55℃, 15sec, 72℃, 30 sec, 10 cycles.

12.再89℃, 15 sec, 55℃, 15 sec, 72℃, 30sec, 20 cycles.

13.再final extention 72℃, 30min, 保存在4℃.

14.之后由A1, A2中各取7.5μl, A3, A4中各取5μl, A5, A6中各取10μl, 置入A7中.

15.同樣將B1, B2中各取7.5μl, B3, B4中各取5μl, B5, B6中各取10μl, 置入B7中.

16.再由A7中取1μl置入A8, 由B7中取1μl置入B8. (若使用Kit B則各為2μl).

17.然后方子A8, B8中各加入formamide size standard mix 12μl. 將A8, B8離心1,000rpm, 15sec, 置95℃, 5min, 置冰上.

準(zhǔn)備deionized formamide：

1.     50ml加5g ion-exchange formamide resin(AG501×8 from BioRad), 攪拌30min, 以試紙測(cè)pH若在7~9之間則可.

2.     將deionized formamide以2 micron濾器過(guò)濾, 分500μl保存-20℃. 若在7~9之間則可

3.     將formamide吸入另一加有5g ion-exchange之燒杯再攪拌30min, 以試紙測(cè)pH若在7~9之間則可, 分500μl保存.

準(zhǔn)備formamide size standard mix：

1.     5μl size standard＋12μl deionized formamide, 緩速vortex 5sec, 離心1000rpm, 15sec, 保存于4℃.

準(zhǔn)備Matrix standard samples：

1.     1μl matrix standard＋12μl deionized formamide, 緩速vortex 5sec, 離心1000rpm, 15sec, 保存于4℃.

Denature Matrix standard samples：

1.     將sample置95℃ 5min, 再置冰上待用.

2.     然后, 將上述樣本依A7, A8, 及4種matrix standard samples分別置autosampler tray上的右起第1排之1~6位上. 而Kit B的樣本置另一tray上排列方式比照.

3.     再準(zhǔn)備Genescan sample sheet, 依Kit A或B分別設(shè)定, 再設(shè)定Genescan injection list, 機(jī)器會(huì)自動(dòng)執(zhí)行每樣本1次, 若要多于1次, 要重覆設(shè)定, 在第1樣本前, 加1行, 設(shè)定module為Test CCD4-color, 如排序時(shí)一樣, 但collection time改為1min, 以測(cè)毛細(xì)管裝置是否妥當(dāng), 若baseline值＜2,068則可. 再按Run則開始. 在run時(shí), 可隨時(shí)由電腦監(jiān)看.

4.     設(shè)定GeneScan Matrix File方式與排序類同.

5.     Run結(jié)束, 不論排序或Scan均要將玻璃針筒洗淨(jìng), 加dH2O 250μl, 關(guān)掉所有valves, 將Syringe drive移至250處, 然后run Seq Fill Capillary module, 使polymer洗淨(jìng), 約6min. 將毛細(xì)管取出兩瑞插入含水離心管中保存.