DNA-Protein交互作用的研究

許多基因功能控制受到與此基因中某一片斷與某特殊蛋白質(zhì)的結(jié)合之影響,
為研究此種關(guān)係而研發(fā)出一些技術(shù). 要研究此一主題, 首先必須先進(jìn)行細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中物質(zhì)的抽提.

細(xì)胞核物質(zhì)抽提

材    料：

哺乳類動(dòng)物細(xì)胞(可用組織培養(yǎng)細(xì)胞如Hela)

PBS

Hypotonic buffer

Low-salt buffer

High-salt buffer with 1.2M KCl

Dialysis buffer

Liquid nitrogen

玻璃製Dounce homogenizer

Dialysis membrane tubing (孔洞分子量≦14,000)

導(dǎo)電測(cè)量器

方    法： (此方法均再4℃進(jìn)行)

1.     需用5~10×108cells/liter的組織培養(yǎng)細(xì)胞, 以250ml離心管, 離心20min, 4,000rpm. (若為monolayer細(xì)胞, 應(yīng)以塑膠刮刀將細(xì)胞刮下放入離心管中, 細(xì)胞要先以PBS洗過(guò)在刮下.) 倒去上清.

2.     估計(jì)沉淀物之大略體積, 加入體積量5倍的PBS, 溷合后, 離心10min, 4,000rpm, 倒去上清.

3.     將沉淀細(xì)胞溶于hypotonic buffer(約沉淀體積5倍量), 離心5min, 4,000rpm, 倒去上清. 此一步驟動(dòng)作要快, 以免細(xì)胞破裂損失抽提物質(zhì).

4.     加入原沉淀細(xì)胞體積3倍的hypotonic buffer, 置冰上10min, (此外原沉淀體積留在第二步驟時(shí)所得體積, 因在第三步驟時(shí)體積因細(xì)胞膨脹而增大了).

5.     將細(xì)胞倒入Dounce homogenizer, 上下壓榨細(xì)胞(處理時(shí), 動(dòng)作輕, 以免傷及細(xì)胞核).

6.     將均質(zhì)后的細(xì)胞倒入離心管, 離心15min, 4,500rpm, 分開保留上輕與沉淀物二者. 上清用于抽提細(xì)胞植物, 沉淀物用于抽提細(xì)胞核內(nèi)物質(zhì).

7.     估計(jì)沉淀物體積, 加入約體積1/2倍的low-salt buffer, 然后一邊攪拌, 一邊一滴一滴加入high-salt buffer, 直到約1/2的沉淀物體積為止.

8.     緩緩振動(dòng), 30min, 再離心15,000rpm, 30min, 上清液就是核內(nèi)粹取液.

9.     將粹取液放入透析膜內(nèi), 以50倍液透析, 直到可以導(dǎo)電器量出袋內(nèi)外之導(dǎo)電度相同為止. (2ml以下量約1hr, 100ml約5hr)

10.取出粹取物, 離心15,000rpm, 20min, 保留上清. 用小量測(cè)蛋白質(zhì)濃度, 其馀保存在-70℃.

接著將前述步驟6中的上清物, 用來(lái)提取細(xì)胞質(zhì)粹取物.

材    料：

10x cytoplasmic extract buffer

方    法：

1.     取細(xì)胞質(zhì)(上清液)量0.11倍體積的10x cytoplasmic extract buffer加入溷合.

2.     離心16,000rpm, 1hr, 將上清液倒入透析膜內(nèi), 至膜內(nèi)外導(dǎo)電度相同為止.

3.     取出粹取物, 離心15,000rpm, 20min, 保留上清, 保存于-70℃.

配方：

10x cytoplasmic extract buffer：

0.3M HEPES, pH7.9, 4℃

1.4M KCl

0.03M MgCl2

Dialysis buffer：

20mM HEPES, pH7.9, 4℃

20﹪glycerol

0.2mM EDTA

0.2mM PMSF (phenyl methylsulfonyl fluoride)

※ 此化合物溶于isopropanol, 應(yīng)先調(diào)0.2M的儲(chǔ)存液備用, 在使用前才滴入.

0.5mM DTT (Dithiothreitol)

※ 必須使用前才加入.

High salt buffer：

20mM HEPES, pH7.9, 4℃

25﹪glycerol

1.5mM MgCl2

0.8, 0, 1.2, 1.4或1.6M KCl (用于測(cè)試何種濃度下可萃取最高量的物質(zhì), 若無(wú)足夠時(shí)間, 取1.0或1.2M試之)

Hypotonic buffer：

10mM HEPES, pH7.9, 4℃

1.5mM MgCl2

10mM KCl

0.2mM PMSF (使用前加入)

0.2mM DTT (使用前加入)

Low salt buffer：

配方同high salt buffer, 而KCl用0.02M即可.

附注：

1.     以此方法測(cè)得結(jié)果約8mg/ml細(xì)胞蛋白質(zhì).

2.     做DNA-Protein交互作用研究, 方法為將核或細(xì)胞質(zhì)提取之蛋白質(zhì)與想研究的DNA片斷結(jié)合, 并以電泳處理, 受結(jié)合的DNA會(huì)跑得慢. 另外, 亦可以Dnase I處理, 凡有結(jié)合的DNA不受切割, 方法很多, 容后再介紹.